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探索長鏈非編碼RNA的世界 各路工具來幫忙[new]

【字體: 時間:2017年01月11日 來源:生物通

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  長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一個變廢為寶的典型。之前,由于不編碼蛋白質,這些lncRNA一直被嘲笑為“垃圾DNA”。然而,多年的研究終于為lncRNA正名,雖然不編碼蛋白質,但它對基因表達還是有很大貢獻的。于是,lncRNA成為生物學研究的新熱點。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一個變廢為寶的典型。之前,由于不編碼蛋白質,這些lncRNA一直被嘲笑為“垃圾DNA”。然而,多年的研究終于為lncRNA正名,雖然不編碼蛋白質,但它對基因表達還是有很大貢獻的。于是,lncRNA成為生物學研究的新熱點。

探索lncRNA的世界,當然需要一定的工具。所幸,lncRNA與mRNA有些相似,故標準的基因表達分析工具(如定量PCR、芯片、測序)也能派上用場。據專家介紹,唯一需要注意的就是靈敏度。美國Beckman研究所的John Rossi認為,分離和研究lncRNA不需要特殊的工具,但需要方法來檢測它們,因為它們通常豐度很低。

lncRNA研究的技術路線可參照mRNA或miRNA:首先利用轉錄組測序(RNA-Seq)或芯片來開展lncRNA的表達譜分析,之后通過qRT-PCR或Northern blot來驗證。這些主要用于lncRNA的定性或定量分析,而在功能分析中,抑制或過表達、RIP都是十分常用的工具。

芯片

對于lncRNA的表達譜分析而言,芯片是個強大的工具。目前有多家公司提供lncRNA的芯片和服務,包括Arraystar、Affymetrix、安捷倫等。

美國Arraystar公司自2009年起一直專注于lncRNA芯片的開發,如今已推出第四代產品——Arraystar Human LncRNA Microarray v4.0。它的國內代理公司為康成生物,獨家提供Arraystar lncRNA芯片技術服務。到目前為止,康成客戶采用Arraystar lncRNA芯片發表的SCI論文已經超過180篇,其中多篇發表在《Cancer Cell》、《Hepatology》、《Blood》等國際頂尖雜志上。

LncRNA芯片讓您能夠在單張芯片上同時分析lncRNA和mRNA的表達譜。這樣,您不僅能夠了解差異表達的lncRNA和mRNA,還能清楚它們之間的關聯。與傳統芯片不同,Arraystar lncRNA芯片采用了“轉錄本特異”的探針設計,可準確檢測由一條原始轉錄本來源的不同RNA。它還提供了系統而實用的lncRNA注釋,為深入研究其復雜功能提供參考信息。

近日,上海交通大學附屬仁濟醫院房靜遠教授的課題組應用美國Arraystar公司的lncRNA芯片分析了胃癌組織的lncRNA表達情況,篩選到可預測胃癌發生的分子標志物GClnc1,并且闡明了GClnc1在胃癌的發生和發展中是如何發揮調控作用的。這項研究成果發表在著名學術期刊《Cancer Discovery》(影響因子19.783)上。

此外,Arraystar公司還最新推出了nrStar™ Human Functional LncRNA PCR Array,可同時檢測372個功能已知或疾病相關的金標準lncRNA。這些lncRNA來自科學文獻和最新數據庫。與大部分功能未知、序列殘缺的lncRNA相比,產品中的lncRNA特征明確,信息完善。

若有意了解lncRNA芯片技術服務的更多信息,請咨詢康成生物。

賽默飛世爾旗下的Affymetrix也提供了轉錄組分析的好工具——GeneChip® Human Transcriptome Array 2.0。這款俗稱HTA 2.0的芯片設計了近700萬條探針,可檢測超過28萬條全長轉錄本,包括超過24萬條編碼轉錄本和超過4萬條非編碼轉錄本。為支持這一海量數據的分析,Affymetrix還開發出了TAC軟件。索取HTA 2.0芯片的更多資料

2014年,我國著名的免疫學家曹雪濤院士在《Science》雜志上發表文章,探究了lncRNA在樹突狀細胞分化及功能中的作用。在分析中,研究人員首先利用HTA 2.0芯片來檢測單核細胞分化至樹突狀細胞的過程中lncRNA的表達變化。之后通過層層分析,他們鑒定出一個關鍵的lncRNA(lnc-DC),并驗證了其功能和作用機制。

安捷倫的SurePrint G3基因表達譜芯片也將編碼和非編碼RNA整合在單張芯片上,實現了lncRNA 和蛋白編碼基因的同步檢測。這是安捷倫與 John Rinn 實驗室(隸屬于麻省理工學院-哈佛大學Broad研究所)合作的成果。

這款8x60K的芯片在2010年首次推出,如今已升級到第2版,更好地反映了目前對lncRNA表達和結構的了解。2011年秋天,John Rinn 實驗室的Moran Cabili及其同事深入研究了來自24個人類組織和細胞系的RNA-seq數據集,并鑒定出近8,200個假定lncRNA,包括4,662個嚴格的lncRNA。第二版的芯片正是反映了lncRNA目錄的更新,同時也包含了新的mRNA探針。

SurePrint G3人類基因表達譜v2芯片具有寬廣的動態范圍(超過五個數量級)和極高的靈敏度,可同時檢測樣本中的低表達和高表達目標。安捷倫的芯片一貫靈活,充分支持研究者設計與其實驗相關的各種定制芯片。


RNA-Seq

在lncRNA的發現階段,新一代測序平臺無疑是人們最得力的助手,而許多新的發現也正是來源于此。通過表達譜分析,人們可以鑒定在發育或特定情況下差異表達的lncRNA,從而揭開它們的潛在功能。或者,人們尋找表達關聯的lncRNA和蛋白編碼基因,了解共同調控。

2015年,加州大學洛杉磯分校的研究人員利用RNA測序來分析人類骨髓和胸腺祖細胞中的lncRNA。通過這些稀有細胞的分析,研究人員發現了3,000多個以前未知的lncRNA,讓科學家對“人類免疫系統如何發展”有了一個全新的認識。這項成果發表在免疫學頂級雜志《Nature Immunology》上。

同樣地,在上面提到的曹雪濤院士的研究中,研究人員也使用了新一代測序。他們用Illumina HiSeq 2000測序儀來檢測樹突狀細胞分化時第0天和第7天的lncRNA表達情況,發現99個lncRNA差異顯著。之后,他們再結合芯片的分析結果,挑選出表達倍數高的lnc-DC作為下一步的研究對象。如此可見,芯片和測序并不是處在對立面的,將兩種技術相結合,結果更具說服力。

當然,并不是每個實驗室都有機會用到新一代測序儀。如果沒有,也可以將測序服務外包。銳博生物推出了lncRNA-Seq服務,通過基于去除核糖體RNA的建庫方法以及高通量測序技術,可以得到細胞內所有RNA轉錄產物的序列,并通過后期的生物信息學分析,可對lncRNA進行深入的研究。咨詢詳情

Northern blot和qPCR

Northern blot和qPCR分析不僅可用于分析lncRNA的表達水平,也常用于驗證芯片或測序的結果。此外,目前也有人利用熒光原位雜交(FISH)技術來檢測和定位細胞中特定的lncRNA。

提到qPCR的分析,我們當然不能忘了金標準的TaqMan Assay。TaqMan® Non-coding RNA Assays是基于久經考驗的TaqMan®分析技術,借助現有TaqMan® Gene Expression Assay的設計渠道來生成分析,以便準確檢測非編碼RNA靶點。據介紹,賽默飛世爾科技提供近25,000個TaqMan Assay,特異針對人、小鼠和大鼠的lncRNA目標。

賽默飛在lncRNA分析的整個流程提供了豐富的產品,從RNA分離到逆轉錄,從qPCR到數據分析,詳見下圖。歡迎索取詳細資料。

lncRNA的功能分析

就lncRNA的功能分析而言,siRNA是大家常用的工具。不過,Exiqon公司還提供了一種更先進的工具。LNA™ GapmeR是一類能高效抑制mRNA和lncRNA功能的反義寡核苷酸,可用于mRNA和lncRNA的功能分析。它的結構中間為一段DNA分子,兩側是經LNA修飾的核苷酸區。這種區域的設計增加了寡核苷酸與靶標的親和性及其本身對核酸酶降解作用的抵抗性,而中間DNA gap結構的作用卻恰恰相反,它激發了RNase H的活性,在DNA與靶RNA結合的部位進行剪切。

除了抑制或過表達的分析,人們也常常使用RNA結合蛋白質免疫沉淀技術(RIP)來分析lncRNA的互作蛋白。默克集團生命科學部則提供了多款試劑盒,可分析各種與染色質相關的RNA,如lncRNA和miRNA。Nuclear RIP試劑盒可分析經過甲醛處理(交聯)或未經過處理(天然)的相互作用。這兩種方法在原理上類似,但所用試劑和操作方案不同。交聯法可捕獲分子量較高的復合物,而天然法傾向于回收親和力高且更直接的相互作用。對于不太熟悉的蛋白質,通常使用兩種方法。立即索取詳細資料

除RIP以外,CLIP也可以幫助人們捕捉與RNA結合蛋白互作的核酸。CLIP方案整合了交聯與核酸酶消化,不僅允許對RNA-蛋白復合物進行進一步的純化(如凝膠電泳片段分離),還能夠揭示RNA-蛋白互作所發生的位點。最近人們又開發出了新型CLIP 技術——iCLIP(individual-nucleotide resolution CLIP),這項技術能夠以單個堿基的分辨率,來展示RNA-蛋白互作的詳細信息。

lncRNA這個全新的世界正等待著我們去探索。盡管我們對它的了解有限,工具也有限,但正是如此,才有可能搶先占領制高點,發表漂亮的文章。(生物通 余亮)

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