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雙特異性polyA加尾法real-time PCR高特異性檢測miRNA[新品推薦]

【字體: 時間:2017年04月24日 來源:英茂盛業

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  在前人工作的基礎上,英茂盛業(inovogen)進一步優化了real-time PCR檢測miRNA的方法,成功采用雙特異性polyA加尾法檢測成熟和前體miRNA。該方法與原有的方法相比,實驗成本更低、工作流程簡便、特異性更高。

miRNA(microRNA)是一類極小的非編碼RNA,具有多種生物調節功能。由于miRNA一般僅20bp左右,長度僅相當于普通引物,因此給miRNA檢測帶來較大難度。

Rea-ltime PCR檢測由于其高特異性和高效性已經被視為各種核酸定量檢測的金標準。盡管miRNA檢測的特殊性極大增加了Real-time PCR檢測難度,迄今為止,科學家已經研發出了蝎形引物特異性反轉錄、Taqman探針檢測、polyA加尾法等多種方法,成功對pre miRNA,成熟miRNA進行了檢測,并且對高度近似的miRNA家族進行有效區分和檢測。

在前人工作的基礎上,英茂盛業(inovogen)進一步優化了real-time PCR檢測miRNA的方法,成功采用雙特異性polyA加尾法檢測成熟和前體miRNA。該方法與原有的方法相比,實驗成本更低、工作流程簡便、特異性更高。

雙特異性polyA加尾法優點:

▪ 一步完成所有miRNA的反轉錄
▪ 真實反映miRNA表達水平
▪ 高特異性PCR檢測,有效區分相似miRNA

雙特異性polyA加尾法工作原理示意圖:


 
圖1、雙特異性polyA加尾法qPCR原理

雙特異性polyA加尾法與其他檢測方法比較:

蝎形引物特異性反轉錄SYBR檢測

蝎形引物特異性反轉錄Taqman探針

雙特異性polyA加尾法

單特異性polyA加尾法

特異性

較高

較高

靈敏度

內參

需要單獨轉錄,可靠性低

需要單獨轉錄,可靠性低

同時轉錄,可靠性高

同時轉錄,可靠性高

實驗復雜程度

實驗成本

非常高

雙特異性polyA加尾法檢測miR371和miR372 5p及3p

我們采用雙特異性polyA加尾法檢測了人肝癌細胞株中miR371-5p、miR371-3p、miR372-5p、miR372-3p。可以看出該方法對4個miRNA都實現了高特異性擴增和高效檢測。


 
圖2A:miR371和miR372 5p及3p 熔解曲線分析


 
圖2B:miR371和miR372 5p及3p 擴增曲線分析

雙特異性polyA加尾法精確檢測不同樣品中的miR200c 3p表達量

我們提取了4個不同細胞株的樣品,采用雙特異性polyA加尾法檢測了miR200c-3P表達量。在轉錄的RNA總量和內參U44 Ct值(未顯示)基本一致的情況下,miR200c-3P檢測結果反映出不同細胞株中該miRNA表達的顯著差異。值得注意的是,在其中一個細胞株中該基因表達量很低。在Ct值大于35區域也取得了較準確的檢測效果。


 
圖3B、miR200c-3P 擴增曲線分析


 
圖3B、miR200c-3P 熔解曲線分析

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了解如何利用雙特異性polyA加尾法檢測成熟和前體miRNA

咨詢熱線:13681365274
QQ:1291769782
網址:
www.inovogen.com

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