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混合shRNA篩選——高通量、低成本、靈活的功能性基因篩選方法

【字體: 時間:2017年06月07日 來源:基因有限公司

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  混合干擾文庫( pooled shRNA library)篩選作為一種高通量基因功能研究工具,使得在一個細胞培養體系中同期對成千上萬條shRNA進行條件篩選成為可能。

引子:有了靶基因,很容易就可開展RNAi研究對基因功能進行深層次解析。然而,當有多個基因可能與研究的表型相關時,逐個基因進行研究已然不是一個科學快速的解決辦法。混合干擾文庫( pooled shRNA  library)篩選作為一種高通量基因功能研究工具,使得在一個細胞培養體系中同期對成千上萬條shRNA進行條件篩選成為可能。

混合shRNA篩選文庫:功能性基因篩選研究策略

RNAi篩選作為一種與時俱進的研究高新技術,大大便捷了研究者們對生物過程和疾病相關表型的分析。全基因組覆蓋的shRNA文庫已經被普遍商業化,這也大大點燃了科學界用RNAi方法進行研究的熱情,然對高通量RNAi后期的復雜數據分析卻是另一個極大的挑戰。將混合shRNA文庫與NGS測序技術完美結合的研究策略,使得高通量RNAi篩選進入了快速分析的嶄新時代。

合成型siRNA和shRNA表達質粒的實驗室應用已經對基因功能缺失性研究產生了深遠影響。然而,之前的研究技術不僅費時費力,而且性能不穩定。如今,RNAi干擾文庫已經被商業化且可以沉默基因組上的任何基因。但是siRNA文庫適用于基于多孔板的高通量干擾分析,單孔單基因進行干擾篩選,費時費力;shRNA文庫不僅可以用于單孔單基因的干擾篩選,而且也可以進行混合競爭性干擾篩選分析(barcode screening),短期內就可以在同一群細胞中進行成千上萬種shRNA的同步分析,實驗方案更靈活,更便捷。( Sims D. et al.  High-throughput RNA interference screening using pooled shRNA libraries and next generation sequencing. Genome Biology 2011, 12:R104 )

高通量基因功能篩選策略:
單孔單基因研究VS混合干擾文庫篩選

混合shRNA篩選文庫構建

全球有多個研究小組和公司都致力于基因組覆蓋范圍的shRNA文庫的構建工作。下表中匯總了截止到2012年已有的多個shRNA文庫的基本情況,包括NKI(Netherlands Cancer Institute)文庫、TRC(the RNAi consortium)文庫、Hannon-Elledge文庫和SystemBio(System Biosciences)文庫。這些shRNA文庫在文庫大小、基因組覆蓋度、shRNA序列設計及shRNA表達策略上都差異顯著:NKI文庫、TRC文庫和SystemBio文庫都是利用RNA聚合酶III系統表達單純的shRNA來模擬內源性的pre-miRNA(miRNA前體)進行RNAi;而Hannon-Elledge文庫利用RNA聚合酶II系統表達類天然miR30初級轉錄本形式的shRNA來模擬內源性pri-miRNA進行RNAi。基于此,各shRNA文庫都具有各自的特點。(Hu G and Luo J. A primer on using pooled shRNA libraries for functional genomic screens.  Acta Biochim Biophys Sin. 2012 Feb;44(2):103-12)

各shRNA文庫性能比較。(本圖摘自Hu G and Luo J. A primer on using pooled shRNA libraries for functional genomic screens.  Acta Biochim Biophys Sin. 2012 Feb;44(2):103-12  Table 1)

混合shRNA篩選文庫:功能性基因篩選流程

Pooled shRNA文庫篩選策略以pooled干擾慢病毒文庫轉導細胞開始,轉導需保證單細胞單shRNA整合。隨后,給細胞培養體系施加選擇壓力,挑選出理想表型(對細胞進行活力篩選、報告基因表達篩選或者行為篩選等,摘自Hu G and Luo J.  Acta Biochim Biophys Sin. 2012 Feb;44(2):103-12)。整合到細胞基因組內的shRNA通過NGS測序進行分析。對于目前已知的基因家族、信號通路及表觀遺傳學家族的基因,均有商品化的高通量干擾產品套裝方便進行混合篩選;對于多個基因家族的基因干擾產品組合套裝,可以進行個性化定制。

高通量基因功能篩選流程圖:
活力鑒定、報告基因篩查或者行為篩選等,摘自Hu G and Luo J.  Acta Biochim Biophys Sin. 2012 Feb;44(2):103-12

新型混合shRNA篩選文庫2014震撼問世:shRNAmir

高通量干擾研究對shRNA提出了更高的要求,即單拷貝shRNA載體整合到基因組上也要有干擾潛能。這才能保證細胞群體以低感染復數(MOI)進行干擾病毒的高通量篩選時每個細胞表達唯一的功能性shRNA。冷泉港RNAi中心實驗室負責人Gregory Hannon教授的專利shERWOOD算法( Knott et al. 2014. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell (2014) )進行shRNA設計,采用內源性miR30 scaffold表達模式,結合體外強大的sensor assay驗證數據佐證( Fellmann et al.. Mol Cell. 2011 Mar 18;41(6):733-46.),保證每一條設計出來的shRNA都在單拷貝水平上有高干擾效率,且低毒、原生態表達,非常契合混合篩選實驗對載體的高要求。目前該項專利技術已經授權transOMIC廠家進行shRNA高通量篩選文庫的商業化生產(包括混合shRNA文庫及array高通量文庫)。

transOMIC部分現有shRNA篩選文庫枚舉

對于沒有NGS測序平臺或者NGS數據分析能力不足的客戶,transOMIC公司還為這類客戶提供數據分析的個性定制服務!如果客戶需要幫助分析pooled混合篩選后的結果,僅需將篩選后樣本提取的基因組DNA交給transOMIC,后續測序+數據分析,一步到位!更多詳情可咨詢基因公司或登錄http://www.transomic.com/Products/RNAi/Pooled-shRNA-Screening-Libraries/Product-Overview.aspx進行了解。

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