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動物用siRNA體內實驗常見問題解答及實驗案例

【字體: 時間:2020年01月09日 來源:銳博生物

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  我們應該如何設計動物實驗方案?如果自己時間緊任務重,希望快速得到接近臨床意義的實驗結果,該選擇化學合成的siRNA呢,還是用慢病毒或腺病毒類shRNA?今天,銳博小編就siRNA動物實驗的常見的問題進行匯總與解答,最后分享一篇in vivo siRNA的案例。

當您完成了細胞篩選及功能實驗之后,通常下一步會開展動物實驗,而動物實驗(Animal Experiments or In Vivo Study)經常是通往高分文章的必經之路。那么,我們應該如何設計動物實驗方案?如果自己時間緊任務重,希望快速得到接近臨床意義的實驗結果,該選擇化學合成的siRNA呢,還是用慢病毒或腺病毒類shRNA?今天,銳博小編就siRNA動物實驗的常見的問題進行匯總與解答,最后分享一篇in vivo siRNA的案例。

 
銳博生物動物實驗整體服務項目一覽圖

動物用siRNA常見問題與解答

Q1:化學合成siRNA和病毒類shRNA,到底該選哪一種呢?

答:如果您希望以更加經濟、安全和在更短實驗周期內得到接近臨床意義的實驗結果,我們推薦您采用化學合成的in vivo siRNA。原因有:
1. 實驗周期更短:化合合成siRNA實驗操作簡單,屬于即用型體系,提交合成需求之后7-15天就可以打動物;而病毒類shRNA需要構建和篩選穩轉細胞株,一般需要2個月,存在突變風險;
2. 安全性更好:化學合成siRNA屬于寡核苷酸物質,安全性好;而病毒類對實驗室安全級別有要求,可能導致過感染,實驗過程中對操作者也有潛在危害。
3. 經濟性更高:siRNA單次制備費用低,可靈活選擇修飾和定制規格;病毒類定制費用昂貴,且定制方面靈活性差。
4. 更接近臨床意義:以注射成瘤裸鼠為例,用腫瘤細胞注射構建腫瘤模型,成瘤后再注射in vivo siRNA,觀察瘤體生長速度減慢或縮小,局部和全身給藥操作簡單,可用于原位癌和轉移癌等已經擴散的癌癥;而用病毒構建穩轉細胞株接種動物,直接注射病毒感染細胞,容易導致較強的細胞毒性、肝毒性,特別不適用于原發癌和轉移癌等已經擴散的癌癥。

Q2:動物用siRNA是否需要經過特殊修飾或制備?需要滿足哪些條件?

答:由于動物體內生理環境非常復雜,動物用siRNA(又稱in vivo siRNA)一般必須要提高其在體內的穩定性、半衰期、靶向性、純度、藥活性以及降低毒性等才可以用于體內實驗,通常需要采用特殊的化學修飾或制備工藝以實現上述的目的。一般需要考慮三個因素:

① 穩定性:siRNA 易被酶降解,難以在體內持續發揮作用。
② 安全性:siRNA非特異作用引起“脫靶” 效應,外源RNA引發免疫反應。
③ 給藥方式:必須提高 siRNA 生物利用度,有效作用于病變區域。

銳博生物采用自主專利siRNA化學修飾技術,原料全部采用高品質進口原料,通過嚴格質量檢測控制體系,有效增強in vivo siRNA的穩定性,修飾不影響siRNA發揮作用,具有良好siRNA血清穩定性,并保持siRNA高效活性,更大限度降低siRNA對實驗動物的毒性,最大限度滿足給藥要求,有效提高in vivo siRNA生物利用度,每批次質量均可溯源和提供完整的質量文件。

Q3:動物實驗用的siRNA有Standard in vivo或in vivo,PAGE in vivo,HPLC in vivo,三者有什么區別,該如何選擇?

答:根據具體情況選擇,三者均是按照動物實驗in vivo標準處理,一般通過反向(Na+)離子交換、動物級別去鹽、濾菌、去內毒素等處理工藝,standard in vivo或in vivo的全長RNA含量不低于80%,適用于普通的動物實驗,費用相對經濟;PAGE/HPLC in vivo是在PAGE/HPLC嚴格的純化之后再經過in vivo處理,PAGE/HPLC的全長RNA含量不低于90%,適用于更高要求的動物實驗,費用相對昂貴。

Q4:siRNA針對不同的器官如何給藥?

答:給藥方法大致分為系統給藥(如靜脈給藥、腹腔給藥等)和局部給藥(如皮下注射,玻璃體給藥,鞘內給藥等)。首先需要根據動物模型和實驗方案,確定給藥量和給藥次數,然后計算出實驗所需的總用量。需要根據不同的器官來選擇給藥方法,而給藥量因不同給藥方法和實驗目的而異。如肝臟、腎臟、肌肉等常用靜脈注射(系統給藥);而皮下腫瘤則常用到瘤內注射(局部給藥)。


in vivo siRNA給藥方式示意圖
(如:口服、靜脈注射、皮下注射、眼內注射、腦室內注射、肌肉注射、椎管內注射、皮內注射、淋巴腔注射、鼻腔注射、舌下注射、腹腔注射等)

口服給藥:安全方便,經胃腸道吸收,這類化合物利用率最低;
腹腔給藥:不存在胃腸道首過代謝,但依然存在肝臟首過代謝,生物利用率較高;
靜脈給藥:不存在吸收屏障和首過代謝屏障,生物利用度最高;
皮下注射和肌肉注射:經皮下和肌肉毛細管吸收,吸收沒有靜脈注射完全,但可避開胃腸道和肝臟首過代謝;
皮內注射:把siRNA藥液注射入表皮和真皮之間,皮內注射吸收較慢;
腦內注射:精確注射藥物進入大腦腦室或大腦特定組織,如海馬體、黑質等,跳過藥物吸收和血腦屏障,給藥體積很小。

從生物利用度的角度,靜脈給藥最高,依次是靜脈給藥>腹腔>肌肉>皮下>口服。

Q5:給藥的推薦量是多大?給藥頻率是多少?

答:對于in vivo siRNA,推薦系統給藥每次注射5~20nmol/20g體重,局部給藥則需每次注射1~5nmol/20g體重,給藥頻率往往是一周2~3次,還可以根據實驗研究目的靈活調整給藥方案。

Q6:局部給藥的使用范圍和作用效果如何?

答:局部給藥(Local administration)的適用范圍是淺表器官和組織,包括眼、肺、腦、肌肉、皮下組織、葉鞘組織等,是最直接最常用的一種導入方式,siRNA 導入效率較高,siRNA的用量少,銳博生物in vivo siRNA提供靈活的生產規格,原料全部采用高品質進口原料生產,采用嚴格工藝控制體系,質量均可溯源。

Q7:系統給藥的使用范圍和作用效果如何?

答:系統給藥(Systemic administration)的適用范圍是具有廣泛的組織分布的器官,包括心、肝、腎、肺等,主要是那些無法通過局部給藥方式到達的靶位,如深入的內臟器官和一些散在分布的靶位(如淋巴細胞,轉移性腫瘤細胞等),一般使用系統注射方式,用量一般較大。銳博生物in vivo siRNA提供大規格定制,原料全部采用高品質進口原料生產,采用嚴格的工作衣控制體系,單批次可達公斤級凍干粉,在批次質量控制上更具優勢。

Q8:如何觀察檢測in vivo siRNA在體內的分布?

答:通過標記上特殊熒光基團,能夠準確分析動物模型中siRNA 給藥情況并不斷優化藥物遞送參數。熒光基團的發射光波長位于近紅外波段,可顯著降低體內自發熒光背景信號干擾。銳博生物為您提供Cy3/Cy5/FAM等熒光標記的in vivo siRNA,通過活體成像技術,即可清晰顯示動物體內藥物分布情況。

In vivo siRNA典型案例解析

這里分享一篇文章:癌細胞需要代謝適應和微環境重塑才能生存和發展,鈣(Ca2+)通量和Ca2+依賴性信號傳導在該過程中起著至關重要的作用,但其潛在機制尚未闡明。浙江大學生命科學學院林愛福課題組發表在Molecular Cell (IF:14.548)上的題為LncRNA CamK-A Regulates Ca2+-Signaling-Mediated Tumor Microenvironment Remodeling,該研究揭示了CamK-A通過激活Ca2+觸發信號傳導參與癌癥微環境重塑的作用機制,證明了lncRNA作為Ca2+依賴性細胞信號傳導重塑乳腺癌腫瘤微環境的新型調節因子,提供了潛在的生物標志物和癌癥治療靶點。

該研究中動物實驗方法

研究人員通過小鼠皮下植入人乳腺患者腫瘤組織瘤構建人乳腺癌模型,然后將膽固醇修飾的CamK-A in vivo siRNA和對照siRNA(均購自銳博生物)稀釋于水中,以20 mg/kg的劑量,通過局部給藥注射到小鼠的乳腺癌腫瘤中,每3天注射1次,連續給藥7周,分析腫瘤(H),生長(I)或體重(J)。

研究發現,下調CamK-A可顯著降低VEGF的分泌和異種移植腫瘤生長,血管生成和巨噬細胞募集也顯著受損。在PDX模型中,通過使用in vivo siRNA(購自銳博生物)敲降CamK-A同樣可顯著減少腫瘤生長、巨噬細胞募集和血管生成。表明CamK-A促進浸潤的巨噬細胞募集、血管生成、腫瘤微環境重塑和癌癥發展,突出其作為潛在治療靶標的作用。

原文:Sang L, Ju H, Liu G, et al. LncRNA Camk-A regulates Ca2+-signaling-mediated tumor microenvironment remodeling[J]. Molecular cell, 2018, 72(1): 71-83. e7.

準備開展miRNA/siRNA體內實驗?歡迎咨詢銳博生物了解詳細方案>>

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